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由于全球氣候變化，大多數(shù)農田栽培的作物都有面臨嚴重脅迫的風險，使農業(yè)產量大大降低。通過成像技術對作物進行感知，可以在早期階段檢測到生物或非生物脅迫，從而避免損害和重大減產。葉綠素a熒光成像技術是用于植物脅迫檢測的專業(yè)技術之一，具有廣泛的國際認可度。它可以評估葉片的時空變化，在出現(xiàn)任何肉眼可見癥狀之前就能對植物生理狀態(tài)進行癥狀前監(jiān)測，從而實現(xiàn)高通量評估。在此，我們將舉例說明如何利用葉綠素a熒光成像分析來評估生物和非生物脅迫。葉綠素a能夠在甜菜夜蛾攝食后15分鐘、西紅柿植株感染灰霉病后30分鐘檢測生物脅迫，或缺水脅迫開始時檢測非生物脅迫，因此具有早期脅迫檢測的強大潛力。葉綠素熒光(ChlF)分析是一種快速、非侵入性、易操作、低成本和高靈敏度的方法，可估測光合作用性能并檢測各種脅迫對植物的影響。在 ChlF 參數(shù)方面，開放的光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應中心的比例(qP)可用于早期脅迫檢測，因為最近的許多研究發(fā)現(xiàn)它是基于ChlF篩選環(huán)境脅迫對植物影響的最準確和最合適的指標。

光合作用的光反應

葉綠素是通過捕光天線吸收光能的主要分子。在光合作用的光反應中，捕光天線吸收的光能會被光化學反應轉化成電子進行傳遞，電子從光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）通過細胞色素b6f和質體藍蛋白（PC）轉移到光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ），最終生成NADPH。除此之外，光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）作為一種大型色素-蛋白質復合物，還負責光合生物中水的光依賴性氧化，釋放分子氧并向類囊體膜內釋放質子（H⁺）。質子最終通過ATP合酶，合成ATP。NADPH和ATP均可用于光合作用的暗反應中CO₂的固定和有機物的合成。

光合作用電子傳遞示意圖

光反應的產物ATP和NADPH必須與碳水化合物和其他必需有機分子的合成相協(xié)調。否則，會產生活性氧（ROS）。在光能轉化為化學能的過程中，活性氧（ROS）在低水平上不斷形成，但它們被不同的抗氧化機制清除。這些 ROS 是單線態(tài)激發(fā)氧（¹O₂）、過氧化氫（H₂O₂）和超氧陰離子自由基（O₂^-）。過量的光能吸收肯定會使電子傳遞鏈容量過度飽和，導致ROS形成的可能性增加。生物和非生物脅迫，如干旱、鹽度、金屬毒性、冷卻、UV-B 輻射、昆蟲和病原體都導致ROS（H₂O₂， O₂^-, ¹O₂，OH）在植物體內產生的量增加，這是由于細胞穩(wěn)態(tài)的破壞，可導致氧化應激。氧化應激是由酶促和非酶促抗氧化劑的ROS產生和清除之間的不平衡引起的。這種不平衡會導致細胞損傷，從而導致細胞死亡。因此，植物需要在細胞結構破壞之前對這種不平衡做出反應，以維持光合活性和全株存活。

葉綠體是植物細胞中ROS最重要的創(chuàng)造者，尤其是光合作用的光反應。在大多數(shù)環(huán)境脅迫條件下，吸收的光能超出其可控制的量，因此會損害葉綠體。保護光合設備免受導致ROS產生的過量光能的過程是非光化學淬滅（NPQ）的機制。植物已經發(fā)展了幾種光保護機制，包括光通過葉片和葉綠體運動逸出，NPQ機制通過吸收的光能作為熱能耗散，PSⅠ周圍的循環(huán)電子傳輸，光呼吸途徑和ROS清除系統(tǒng)。NPQ的產生可以避免在環(huán)境脅迫條件下經常觀察到的ROS生成增加。然而，酶促和非酶促抗氧化機制可以消除環(huán)境脅迫條件下ROS生成的增加。

葉綠素熒光分析方法分辨率高、快速、無損、成本低，可以通過監(jiān)測PSⅡ的葉綠素熒光發(fā)射來評估光化學的任何變化。該方法可以準確地確定用于光化學的能量(Φ_PSⅡ)，以熱量(Φ_NPQ)，或非穩(wěn)壓耗散在 PSⅡ中(Φ_NO)。

葉綠素a熒光分析的基礎知識

植物的葉綠素熒光來自吸收的光能中的一小部分重新以光的形式發(fā)射，葉綠素熒光可以用來解釋植物能量轉換相關的為光合作用活性，為光合裝置，特別是PSⅡ提供了有價值的見解。葉綠素分子（Chl）吸收光能將其轉化為激發(fā)態(tài)（Chl*），其能量較高，具體取決于用于照明的光波長。激發(fā)的葉綠素分子（Chl*）可以以兩種激發(fā)態(tài)存在：單態(tài)葉綠素分子（¹Chl*），具有相對短的壽命以及壽命更長的三態(tài)葉綠素分子（³Chl*）。單線態(tài)激發(fā)態(tài)葉綠素分子（¹Chl*）可以通過（i）耗散能量為熱(NPQ)，（ii）將能量轉移到另一個電子受體分子，稱為光化學（qP），或（iii）以熒光的形式重新發(fā)射為光，葉綠素熒光波長比吸收光更長。在這些途徑中，可用于去激發(fā)¹Chl*的是光化學反應，它將光能轉化為電子傳遞用于合成化學產物。當光合作用高效進行時，觀察到的熒光很少。在以下情況下¹Chl*不是通過上述途徑去激發(fā)的，它是從高能激發(fā)態(tài)轉換而來的1Chl* 至低能激發(fā)態(tài)³Chl*通過內部轉換或松弛。三態(tài)葉綠素分子（³Chl*）能與分子O₂反應產生單氧（¹O₂*），一種非?；顫姷幕钚匝酰≧OS）。在環(huán)境溫度下，大多數(shù)熒光來自與PSⅡ相關的葉綠素a分子。

葉綠素分子激發(fā)與能量去向示意圖

測量葉綠素a熒光

葉綠素a熒光可以使用各種方法進行檢測，例如脈沖振幅調制(PAM)方法。在開始測量之前，葉片必須經過幾分鐘或者幾十分鐘的暗適應，這取決于測量前葉子所處光環(huán)境的光強度和植物物種。黑暗中葉綠素a熒光的最小水平Fo通過低強度測量光ML獲得，而暗適應葉片的最大熒光產量Fm則用飽和光脈沖SP進行評估。在光化光照明AL（即施加的光強度）下，可以使用另一個飽和脈沖估計光適應狀態(tài)下的最大熒光Fm′。在施加的光化光AL關閉之前測量熒光的穩(wěn)態(tài)水平Fs。除此之外，在關閉AL后，開可以測到另一個葉綠素熒光的最低水平Fo′。Fm′和Fo′之間的差異是光下的最大可變熒光Fv′。根據(jù)這些測量的基本葉綠素熒光參數(shù)，可以計算出其他一些更常用于葉綠素熒光分析的參數(shù)。

脈沖振幅調制葉綠素熒光測量過程示意圖

葉綠素熒光成像用于非生物應激檢測

水分充足（對照）的擬南芥（a）和缺水脅迫開始時（對照植株土壤容積含水量的 95-96%, SWC）的擬南芥（b）葉片上開放的 PSⅡ 反應中心（qP）的差異。右側的顏色代碼表示qP值，范圍從0到1。

在0 μM（對照）、40 μM或 120 μM Cd²⁺ 脅迫條件下生長3天和4天的Noccaea caerulescens植株。圖中顯示了開放的PSⅡ反應中心的比例（qP）。右側的顏色代碼顯示 qP值的范圍為0.0至1.0。

Noccaea caerulescens中開放的PSⅡ反應中心部分（qP）對鎘暴露的U型雙相響應曲線。在 40 μM 的鎘濃度下暴露3天后，觀察到開放的 PSⅡ 反應中心(qP)的比例下降，而暴露時間更長(4 d)后，由于誘導了應激防御反應，qP增加。同樣的120 μM Cd暴露時間（3天）導致qP增加。這種激素反應被認為是由ROS水平的增加引發(fā)的，而ROS 被認為有利于引發(fā)防御反應。

生物脅迫下番茄葉片的葉綠素熒光成像結果。其中每個像素的顏色代表 Spodoptera exigua 幼蟲取食前（a）和取食15分鐘后（b）番茄小葉中Fm（暗適應最大葉綠素a熒光）。(a)中用圓圈表示取食前的十個感興趣區(qū)域（AOIs），(b)中為相同的感興趣區(qū)域、兩個取食點（星號表示）和另外五個感興趣區(qū)域（箭頭表示）。白色箭頭所指的取食點覆蓋了整個 AOI。黑色箭頭指向現(xiàn)有AOI附近的周圍區(qū)域。AOI 的圓圈上有紅色標簽，標注了其所在位置的Fm值。右側的顏色代碼顯示Fm值的范圍為0.0至0.4。

茄科植物小葉在被Spodoptera exigua幼蟲取食前（0分鐘）和取食 15、90和180分鐘后的Φ_PSⅡ、Φ_NPQ和Φ_NO的彩色圖片。取食前的AOIs用圓圈表示，而相同的AOIs、三個取食點的AOIs（用星號和箭頭表示）以及取食區(qū)周圍的AOIs區(qū)則用圓圈表示。AOI的圓圈上還用紅色標簽標注了相應的參數(shù)值。右側的顏色代碼顯示了參數(shù)值的范圍為0.0至0.5。

在植物表型分析中利用現(xiàn)有成像工具具有巨大潛力，可以加快我們對植物功能的認識。這些工具可以建立基因功能與環(huán)境反應之間在代謝、生化和信號轉導過程等多個途徑上的聯(lián)系。在這些工具中，葉綠素熒光成像(ChlF Imaging)分析是一種快速、非侵入性、高成本效益和高靈敏度的方法。這種方法能精確估計光合作用的性能，并能檢測植物受到的各種脅迫影響。葉綠素熒光成像作為一種在肉眼可見的癥狀出現(xiàn)之前檢測生物和非生物脅迫的技術，其潛力已在園藝領域得到證實，并已有效地應用于采收前和采收后的各種情況。葉綠素熒光成像作為一種技術，對于研究生物和非生物脅迫因素下葉片光合作用的異質性特別有價值，而且還能篩選大量樣本，提供早期脅迫檢測診斷。然而，該領域的進一步研究仍然至關重要，其最終目的是加快農業(yè)生產。葉綠素熒光分析方法可用于構建各種作物品種的綜合脅迫耐受性數(shù)據(jù)庫，以便根據(jù)環(huán)境條件優(yōu)化光合功能，應對氣候變化，從而提高作物產量。

在各種葉綠素熒光成像的參數(shù)中，開放的PSⅡ反應中心的比例（qP）被認為是最適合用于早期脅迫檢測的指標。最近的研究一致發(fā)現(xiàn)qP具有很高的靈敏度，非常適合用于探測光合作用的功能，可在早期評估非生物和生物脅迫對植物的影響。我們建議科學家在進一步的研究中考慮將QA 氧化還原狀態(tài)的葉綠素熒光參數(shù)納入其工作中。

本研究中葉綠素熒光成像的圖片由IMAGING-PAM獲得。

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