應(yīng)用自動在線流式細(xì)胞術(shù)實時監(jiān)測海洋海岸微生物濃度
日期:2023-03-16 16:21:08
摘要

海洋微生物無處不在,通過光合作用和生物地球化學(xué)循環(huán)等關(guān)鍵過程,在海洋中發(fā)揮著基本作用。由于其很高的更替頻率和不完整的分布,監(jiān)測時需要在正確的時間和空間取樣。使用兩個在線流式細(xì)胞儀系統(tǒng)對那不勒斯灣沿岸地區(qū)的海洋微生物進行了監(jiān)測,驗證一種新的概念,證明該技術(shù)可以作為一個實時水質(zhì)報警系統(tǒng)的有用工具。建議將細(xì)菌和微型浮游植物濃度作為水質(zhì)的一般指標(biāo),這是評估環(huán)境條件變化的影響所必需的第一步,隨后將深入分析群落組成是否存在病原體或其他指標(biāo)。在調(diào)查期間,我們發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)處理的城市廢物排放區(qū)或河流輸入?yún)^(qū)細(xì)菌濃度高。一般說來,細(xì)菌的豐度與鹽度呈負(fù)相關(guān),這表明它們利用陸地來源的有機物進行生長。所使用的技術(shù)方法也是根據(jù)旨在評估和改善歐洲海洋水域質(zhì)量的歐洲指令2008/56/EC,是監(jiān)測沿海地區(qū)的一種有用和快速的方法。
介紹
海洋微生物具有高度的動態(tài)性,對生態(tài)系統(tǒng)性質(zhì)的變化反應(yīng)非常快,從而導(dǎo)致急性污染事件為了捕捉這些反應(yīng)并確定其原因,需要高頻準(zhǔn)確的測量。大多數(shù)用于監(jiān)測海洋微生物的方法都存在重復(fù)性低、響應(yīng)時間長和對勞動力要求高的問題。流式細(xì)胞術(shù)提供了一個解決這些限制的方法,允許快速、準(zhǔn)確和可復(fù)制的海洋微生物計數(shù),并在海洋生態(tài)學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)是一種利用散射和熒光來鑒別和計數(shù)細(xì)胞類型的非軸測、基于單細(xì)胞的方法。由于光合色素的自熒光性,光合微生物可以直接分析,而非自熒光微生物(如異養(yǎng)細(xì)菌)則需要在分析前進行染色。染色步驟需要樣品處理和孵育時間,這是正確評估細(xì)胞濃度所必需的。在環(huán)境科學(xué)中,自動流式細(xì)胞術(shù)已用于自發(fā)熒光微生物和染色后的異養(yǎng)細(xì)菌。我們將這兩種方法結(jié)合起來,分別使用了用于在線分析光營養(yǎng)微生物的Cytosense(CytoBuoy BV)和連接到海洋航行船的泵的OnCyt自動流式細(xì)胞儀(OnCyt Microbiology AG)。證明了高空間分辨率監(jiān)測表面微生物分布是可行的,并提供了有用的第一手信息,可用于快速和實時地指示水質(zhì)。
材料和方法

2017年6月19日在RV Vettoria上采樣。地表水由船泵通過在線熱鹽計 (SBE45 MicroThermalSalinograph,Seabird Electronics),測量溫度和鹽度,并通過在線熒光計測量總熒光(CycloPS7,Turner Design 連接databank)。然后,水流過采樣裝置(Cytobuy BV),并依次通過Cytosense流式細(xì)胞儀(Cytobuy BV)和OnCyt在線流式細(xì)胞儀。

Cytosense每2分鐘分析一次樣品,而OnCyt每13分鐘(取決于染色時間)分析一次樣品,對應(yīng)每1km 采樣一次,取決于船速。常規(guī)流式細(xì)胞儀分析的離散樣本每10分鐘在表面采集一次,以驗證onCyt計數(shù)。在,將這些樣品固定、冷凍并稍后在實驗室用SYBRGreen染色后進行分析。從CytoSense中,獲得了Synechochoccus sp(藍(lán)藻)、微微真核生物(1-3μm大小的混合種群)和納米真核生物的計數(shù)(2-10μm大小),同時onCyt提供非熒光,主要是養(yǎng)細(xì)菌的濃度。
結(jié)果與討論

盡管對于自養(yǎng)微微浮游生物(藍(lán)藻和微微真核生物),onCyt系統(tǒng)與傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的比較已有報道,而且對于異養(yǎng)微生物,onCyt系統(tǒng)已用于淡水系統(tǒng),但其在海水中的應(yīng)用仍需測試。因此,我們調(diào)整了染色方案,以適應(yīng)onCyt在培養(yǎng)溫度和時間方面的需要。為了保證測量的準(zhǔn)確性,在含50 mM EDTA染色之前,樣品中加入多聚甲醛和戊二醛的混合物(1%和0.05%最終濃度)。使用CytSense和onCyt獲得的細(xì)胞計數(shù)與通過常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)獲得的計數(shù)顯著正相關(guān),如圖所示,對于細(xì)菌,計數(shù)和亞群(高核酸,HNA和低核酸,LNA,圖1c和d)都適用。


圖123031504.jpg

圖1 通過CytoSense、onCyt和常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)(Verse)獲得的數(shù)據(jù)驗證。

a)CytoSenseVs Verse藍(lán)藻聚球藻計數(shù)的相關(guān)性b)onCyt Vs Verse總異養(yǎng)細(xì)菌計數(shù)的相關(guān)性c)通過onCyt獲得的異養(yǎng)細(xì)菌的流式圖d)通過Verse獲得的異養(yǎng)細(xì)菌生的流式圖


上船后,兩臺流式細(xì)胞儀在熱鹽分析儀之后連接到船上的采樣線上。然后海水被分成兩條線,一條通向CytSense,另一條通向onCyt。兩臺儀器同時采集了樣本。


圖223031504.jpg

圖2 顯示了船的軌跡以及巡航期間收集的溫度、鹽度和熒光值。

兩個低鹽度區(qū)域很明顯,一個靠近港口(Torre Annunziata),另一個位于受薩諾河(Sarno)影響的區(qū)域。第一個位于離海岸一英里的城市垃圾收集站附近。第二條河流與薩諾河相對應(yīng),薩諾河流經(jīng)幾個農(nóng)村和城市地區(qū),然后排入那不勒斯灣。a)溫度,b)葉綠素?zé)晒?,c)航跡,d)鹽度。箭頭表示鹽度較低的地點,Torre Annunziata(上圖)和Sarno(下圖)


細(xì)菌總濃度顯示出這兩個區(qū)域?qū)?yīng)的峰值,第一個區(qū)域(Torre Annunciata)的最高濃度為1.5 x 106cell/ml,第二個區(qū)域(Sarno)的濃度為1.4 x 106cell/ml(圖3)。盡管HNA在Torre Annunziata占主導(dǎo)地位,但HNA和LNA均存在于Sarno現(xiàn)場(未顯示),表明采樣軌跡沿線的群落組成發(fā)生了變化。事實上,HNA和LNA現(xiàn)在被識別為不同的細(xì)菌集群,最終代表了相同的較大分支,但屬于不同的分類單元,而不像以前認(rèn)為的那樣,是更多(HNA)或更少(LNA)活性細(xì)菌。


圖323031504.jpg

圖3 樣本軌跡(左側(cè))和中異養(yǎng)細(xì)菌總濃度(右側(cè))cell/ ml

在Sarno現(xiàn)場采集的樣本顯示存在大腸桿菌,這是近期糞便污染的指標(biāo),但在Torre Annunziata現(xiàn)場(Milva Pepi,pers.Comm.)沒有,這表明在僅根據(jù)細(xì)菌總濃度正確評估人類健康風(fēng)險之前,進一步進行細(xì)菌分析的重要性。有毒藻類也是如此,其中單獨的分類鑒定并不總是與必須使用其他適當(dāng)?shù)臋z測方法證明的毒素的存在相對應(yīng)。

自養(yǎng)微生物組分也顯示出兩個區(qū)域之間的明顯分離,藍(lán)細(xì)菌聚球藻(Synechococcus)在南部地區(qū)占優(yōu)勢,而微微真核生物和隱藻在北部地區(qū)占優(yōu)勢(圖4)。這也證實了先前的觀察結(jié)果,表明原核生物(藍(lán)藻)與大型真核生物(微微真核生物和隱藻)對不同的環(huán)境線索做出反應(yīng),后者通常負(fù)責(zé)總?cè)~綠素的峰值(如熒光模式所示,圖1b)。


圖423031504.jpg

圖4 樣本軌跡(左側(cè))和a)聚球藻b)微微真核生物c)隱藻濃度cell/ml
結(jié)論

自動高頻流式細(xì)胞儀被證明是一種檢測海洋微生物的成本效益高、速度快的方法,允許實時測量細(xì)胞濃度與環(huán)境因素相關(guān)性,以便解釋和潛在地用作水質(zhì)標(biāo)志,并為進一步干預(yù)鋪平道路。反過來,微生物群落,特別是異養(yǎng)細(xì)菌,似乎是環(huán)境條件變化的有用標(biāo)志,需要考慮并納入水質(zhì)評估,如歐洲指令2008/56/EC所要求的,其目標(biāo)是在2020年內(nèi)達(dá)到所有歐洲水域的良好環(huán)境狀態(tài)(GES)。

由于細(xì)菌細(xì)胞總數(shù)可能不會進一步反映致病性或毒性對人類健康的風(fēng)險,因此必須謹(jǐn)慎行事。然而,流式細(xì)胞術(shù)可能是首次篩選的一種有價值的方法,實時預(yù)警潛在的關(guān)鍵位點,以便通過其他方法進一步監(jiān)測和控制。

參考文獻
[1] O. Guadayol, F. Peters, C. Marrasé, J.M. Gasol, C. Roldan, E. Berdalet, et al. “Episodic meteorological and nutrient load events as drivers of coastal planktonic ecosystem dynamics: a time-series analysis”, Mar. Ecol. Prog. Ser., 2009, vol. 381, pp. 139- 155.
[2] G. Dubelaar, R. Casotti, G.A. Tarran, I. Biegala “Phytoplankton and their analysis by flow cytometry”, In: Dolezel J, Greilhuber J, Suda J: Flow Cytometry with Plant Cells. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007, pp. 287- 322.
[3] D. Marie, F. Partensky, D. Vaulot, C.P. Brussaard “Enumeration of phytoplankton, bacteria and viruses in marine samples”, In: Robinson J.P. (ed), Current Protocols in cytometry, John Wiley & Sons, Inc., New York (NT), pp 11.11.1-11.11.15.
[4] G.B.J. Dubelaar, P.L. Gerritzen, A.E.R. Beeker, R.R. Jonker, K. Tangen, “Design and first results of Cytobuoy: a wireless flow cytometer for in situ analysis of marine and fresh waters. Cytometry, 1999, vol. 37, pp247-254.
[5] M. Thyssen, G.A. Tarran, M.V. Zubkov, R.J. Holland, G. Grégori, P.H. Burkill, et al. “The emergence of automated high-frequency flow cytometry: revealing temporal and spatial phytoplankton variability. J. Plankton Res., 2008, vol. 30, pp333-343.
[6] F. Hammes, T. Broger, H.U. Weilenmann, M. Vital, J. Helbing, U. Bosshart, et al. “Development and laboratory-scale testing of a fully automated online flow cytometer for drinking water analysis. Cytometry A, 2012, vol. 81, pp. 508-516.
[7] M.D. Besmer, D.G. Weissbrodt, B.E. Kratochvil, J.A. Sigrist, M.S. Weyland, F. Hammes, “The easibility of automated online flow cytometry for in – situ monitoring of microbial dynamics in aquatic ecosystems, Frontiers in Microbiology, 2014, vol. 5, art. 265, pp. 1-10.
[8] C. Balestra, L. Alonso-Saez L., J.M. Gasol, R. Casotti, “Group-specific effects on coastal bacterioplankton of polyunsaturated aldehydes produced by diatoms”, Aquatic Microbial Ecology 2011, vol. 63, pp. 123-131.
[9] X.A.G. Moràn, L. Alonso-Saez, E. Nogueira, H.W. Ducklow, N. Gonazalez, A. Lopez-Urrutia, L. Diaz-Perez, A. Calvo-Diaz, N. Arandia-Gorostidi, T.M. Huete-Stauffer. “More, smaller bacteria in response to ocean’s warming?” Proceedings of the Royal Society of London B 282.
[10] P. Lebaron, P. Servais, H. Agoguè, C. Courties, F. Joux, “Does the high nucleic acid content of individual bacterial cells allow us to discriminate between active cells and inactive cells in aquatic systems?” Applied and Environmental Microbiology 67(4): 1775-1782.

如您需要了解更多信息,請識別下方二維碼填寫登記表,我們會為您提供專業(yè)的服務(wù),真誠期待與您的合作!
電話:021-32555118
郵箱:sales@zealquest.com

相關(guān)閱讀:
CytoSense 藻類群落結(jié)構(gòu)分析近期高分文獻速覽
利用EasyClus軟件和CytoSense建立藻類監(jiān)測數(shù)據(jù)庫
CytoSense快速在線分析釀酒酵母生理特性

收 藏