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Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀在小麥孢子發(fā)育及產(chǎn)胚量早期預(yù)測中的應(yīng)用
日期：2020-09-23 10:47:50
單倍體育種作為育種的核心生物技術(shù)之一，具有快速純合基因、縮短育種年限、提高育種效率等優(yōu)勢。這項(xiàng)技術(shù)是基于對處于發(fā)育特定階段的小孢子在進(jìn)行脅迫處理，可使小孢子的配子體途徑發(fā)生重編程轉(zhuǎn)向孢子體途徑，從而產(chǎn)生胚胎。在整個(gè)發(fā)育過程中，雄配子體誘導(dǎo)的產(chǎn)胚率受許多因素的影響，如供體植株的質(zhì)量和生理狀態(tài)、自身基因型、小孢子發(fā)育階段、脅迫誘導(dǎo)預(yù)處理和培養(yǎng)條件等，因此如何提高雄配子體誘導(dǎo)的產(chǎn)胚率是這項(xiàng)技術(shù)成功的關(guān)鍵。


在過去十年中，研究者通常利用染色法和顯微鏡鏡檢來研究小孢子胚性發(fā)育并進(jìn)行產(chǎn)胚量的預(yù)測，由于染色法不具備通用性，不同的物種需要選擇不同的染色劑，導(dǎo)致整個(gè)測試過程繁瑣且費(fèi)時(shí)、耗力。因此，亟需一種可以簡單、快速、可靠檢測小孢子胚性發(fā)育階段的無創(chuàng)檢測工具。有研究報(bào)道，Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC）基于細(xì)胞介電特性可檢測細(xì)胞的大小及活性，已應(yīng)用于細(xì)菌活性、酵母大小，腫瘤細(xì)胞的分化、凋亡和壞死等多項(xiàng)研究中。

本研究利用Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC），進(jìn)行了：（i）離體培養(yǎng)細(xì)胞活力的常規(guī)監(jiān)測；（ii）脅迫處理效率的測定；（iii）小孢子懸浮液中產(chǎn)胚量的早期預(yù)測，探討了小麥小孢子離體培養(yǎng)過程中發(fā)生不同發(fā)育途徑的可能性。研究表明，IFC技術(shù)可以很好的描述細(xì)胞懸浮液中所有小孢子的發(fā)育途徑，包括胚性小孢子和花粉小孢子，可以簡單快速準(zhǔn)確的評估脅迫處理的效率，并在小麥雄核發(fā)育的早期（離體培養(yǎng)的前7天內(nèi)）進(jìn)行產(chǎn)胚量的可靠預(yù)測。

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圖1 IFC法判別小孢子懸浮液（培養(yǎng)1天）中活細(xì)胞和死細(xì)胞
（A）為熱處理后小孢子懸浮液散點(diǎn)圖；（B）為未處理小孢子懸浮液散點(diǎn)圖；振幅代表細(xì)胞大小，相位角代表細(xì)胞活性；（C）為IFC法與染色法相關(guān)性比較（P＜5；=0.9922，n=15）
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圖2 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段（IFC法）
配子體途徑：ML：單核中晚期；EB：早期雙核；LB：單核晚期；ET：三核早期；LT：三核晚期。孢子體途徑：顯示了培養(yǎng)前21天、培養(yǎng)第0、1、5和7天的小孢子發(fā)育狀態(tài)。ML/D-21代表配子體發(fā)育和孢子體發(fā)育的共同階段，紅色垂直門控右側(cè)為活性細(xì)胞，藍(lán)色多邊形門控P1為雄核發(fā)育開始時(shí)的活性孢子群；綠色多邊形門控P2為孢子離體培養(yǎng)前（D0）的活性孢子群；紫色多邊形門控P3為離體培養(yǎng)1天后的活性孢子群。P1、P2、P3三個(gè)孢子群精準(zhǔn)描繪出雄核發(fā)育過程的三個(gè)階段。
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圖3 Pavon小麥配子體和孢子體途徑的發(fā)育階段（顯微鏡）
熒光DAPI染色后，使用可見光顯微鏡觀察小孢子：（A）單核小孢子；（B）雙核小孢子；（C）花粉粒；（D）星形小孢子（v為液泡）；（E）多核小孢子；（F）質(zhì)膜化小孢子。比例尺＝20μm。
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圖4 P1、P2、P3三個(gè)小孢子類群的振幅和相位角中值數(shù)

本次實(shí)驗(yàn)分別在培養(yǎng)前21天、培養(yǎng)第0天和第5天用IFC法檢測了不少于5個(gè)小孢子懸浮液，并分別分析了每個(gè)懸浮液中P1、P2和P3類群中小孢子的活性（振幅A圖）和大小（相位角B圖）。每個(gè)點(diǎn)代表每個(gè)類群內(nèi)小孢子的數(shù)量。Tukey檢驗(yàn)表明，不同培養(yǎng)天數(shù)下，不同類群內(nèi)的孢子數(shù)量沒有顯著變化（p<0.05），進(jìn)而說明IFC法可以精準(zhǔn)描繪出雄核發(fā)育過程。

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圖5 雄核發(fā)育過程中小孢子活力的變化
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圖6 IFC法與顯微鏡鏡檢結(jié)果的比較
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圖7 Pavon小麥小孢子培養(yǎng)早期的產(chǎn)胚量預(yù)測（IFC法）

本實(shí)驗(yàn)利用培養(yǎng)第7天的小孢子懸浮液中P3類群的小孢子的存活率并與產(chǎn)胚量進(jìn)行了相關(guān)性分析，所得線性方程為：y=6.539x-20.827；=0.9519，p<0.05 。結(jié)果表明，IFC法可以在小孢子培養(yǎng)早期進(jìn)行產(chǎn)胚量的準(zhǔn)確預(yù)測。
 
綜上所述，Ampha Z32阻抗流式細(xì)胞儀（IFC）是一個(gè)能夠簡單快速追蹤小孢子的發(fā)育狀態(tài)、評價(jià)脅迫處理效率、進(jìn)行產(chǎn)胚量早期預(yù)測的可靠測量工具。

—— 原文閱讀 ——
Canonge J, Philippot M, Leblanc C, et al. Impedance flow cytometry allows the early prediction of embryo yields in wheat (Triticum aestivum L.) microspore cultures. Plant Science, 2020, 300: 110586.