作者：Ying Tan, Quan Sheng Zhang（張全勝，通訊作者）, Wei Zhao, Zhe Liu, Ming Yu Ma, Ming Yu Zhong, Meng Xin Wang（煙臺大學(xué)海洋學(xué)院）

時間：2019年7月25日

期刊：Photosynthesis Research

英文標題：The highly efficient NDH?dependent photosystem I cyclic electron flow pathway in the marine angiosperm Zostera marina

關(guān)鍵字：環(huán)式電子傳遞、NADPH脫氫酶復(fù)合體、放氧復(fù)合體、跨膜質(zhì)子梯度、大葉藻

過量輻射引起的光合器官的光氧化損傷是影響陸生和海生植物的主要脅迫因子之一。光氧化損傷會破壞ATP和NADPH產(chǎn)生的化學(xué)計量平衡，植物必須對ATP和NADPH進行非常精確的動態(tài)控制，以維持高效的光合作用，滿足植物不同的代謝需求。通過調(diào)整線性電子(LEF)到光系統(tǒng)I循環(huán)電子 (PSI-CEF)的速率，ATP /NADPH比值可以被靈活地調(diào)整到所需的水平。當由兩個光系統(tǒng)驅(qū)動的LEF從水到NADP+時，O2在氧進化復(fù)合體(OEC)發(fā)生進化，同時產(chǎn)生NADPH和ATP。作為一種補充機制，PSI-CEF催化電子從PSI受體轉(zhuǎn)移到質(zhì)體醌(PQ)，使光化學(xué)激發(fā)的電子通過cytb6f復(fù)合物和PC返回到PSI，而不需要凈生成任何基質(zhì)還原劑。在這個過程中，質(zhì)子被從基質(zhì)中取出并泵入到類囊體腔，產(chǎn)生了跨類囊體的質(zhì)子梯度(△pH)，并通過CF0F1-ATP合酶通道驅(qū)動ATP合成。因此，PSI-CEF的活性被認為有助于平衡由光反應(yīng)產(chǎn)生的ATP/NADPH的比例。

在被子植物中至少提出了兩種備選的PSI-CEF通路。主要途徑是涉及質(zhì)子梯度調(diào)節(jié)5 (PGR5)和類PGR5光合顯型1 (PGRL1)的抗霉素a敏感途徑。次要途徑是由對魚藤酮敏感的葉綠體NADPH脫氫樣(NDH)復(fù)合物介導(dǎo)的。擬南芥突變體實驗發(fā)現(xiàn)PGR5/L1和NDH依賴的循環(huán)電子傳遞對跨類囊體膜質(zhì)子梯度分別貢獻30%和5%。葉綠體NDH復(fù)合體是位于類囊體基質(zhì)中的一種多蛋白復(fù)合體，最初是通過與線粒體呼吸電子傳遞中的復(fù)合體I同源而發(fā)現(xiàn)的。迄今為止，在葉綠體NDH復(fù)合體中共檢測到29個亞基，其中包括五個亞復(fù)合體:膜亞復(fù)合體、亞復(fù)合體A、亞復(fù)合體B、腔內(nèi)亞復(fù)合體和電子供體結(jié)合亞復(fù)合體。葉綠體NDH復(fù)合體缺乏氧化NAD(P)H的亞基，但有與Fd位點鏈接的供體連接亞復(fù)合體，NAD(P)H將電子經(jīng)Fd傳遞給NDH復(fù)合體繼而還原PQ庫。

目前提出了依賴NDH的PSI-CEF的三個主要功能：(1)通過下調(diào)通過cytb6/f復(fù)合物的電子輸運以酸化類囊體腔來啟動光保護，并在PSII中誘導(dǎo)非光化學(xué)猝滅的qE組分來消散吸收的多余光能；(2)在各種嚴重脅迫條件下，通過保持ATP/NADPH的高輸出比來保護光合器官免受基質(zhì)過度還原的傷害；(3)產(chǎn)生額外的ATP來驅(qū)動蛋白質(zhì)修復(fù)，滿足植物的各種代謝需求。然而，葉綠體NDH復(fù)合體的生理功能可能因物種、處理條件、生長環(huán)境等有所不同。已有研究表明，NDH依賴的PSI-CEF損傷不影響整體光合作用，說明NDH依賴的PSI-CEF在穩(wěn)態(tài)光合作用中不是必需的，雖然它在波動環(huán)境下的光合調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。一般認為NDH依賴的PSI-CEF不參與弱光條件下的光合作用，但最近的一項研究表明，水稻的NDH復(fù)合體缺失可以在弱光條件下降低碳同化速率和植物生物量積累。絕大多數(shù)的海洋植物(Peltier和Cournac 2002)，以及一些陸生高等植物，如所有種類的球根植物和松科植物，以及部分種類的蘭科和天竺葵科植物，均未檢測到NDH基因編碼。缺乏NDH復(fù)合體，表明該復(fù)合體的功能可有可無，可能存在一些替代或補償?shù)碾娮觽鬟f途徑彌補其功能。相反，NDH復(fù)合體在某些物種中的存在可能提供一個關(guān)鍵的選擇優(yōu)勢，使光合反應(yīng)能夠適應(yīng)環(huán)境壓力。大多數(shù)海洋植物的NDH復(fù)合體的缺失可能與它們相對穩(wěn)定的海洋棲息地有關(guān)。

大葉藻屬(Zostera marina, Zosteraceae)，又稱eelgrass，是一種廣泛分布的海草物種，由陸地單角類的淡水祖先進化而來，并成功地過渡到完全淹沒的海洋分類單元。在進化過程中，基因組的缺失和擴增現(xiàn)象頻繁發(fā)生，為其海洋生活方式所需的結(jié)構(gòu)和生理適應(yīng)提供了遺傳變異。根據(jù)氨基酸序列的多重比對，發(fā)現(xiàn)大葉藻具有完整的29個編碼葉綠體NDH亞基的基因，即使在海洋被子植物中也很少見。分類與大葉藻同目的波喜蕩草屬（Posidonia）和根枝草屬（Amphibolis）未檢測到編碼葉綠體NDH復(fù)合體的基因。因此，葉綠體NDH復(fù)合體在Z. marina的作用需要探索。在本文中，我們提出了在Z. marina中高效的NDH依賴的PSI-CEF，這可能與OEC失活以及光合性能的維持有關(guān)。此外，我們提供的證據(jù)表明，在過量輻照下依賴NDH和依賴PGR5/Li的PSI-CEF之間存在此消彼長的動態(tài)變化。

—— 材料和方法 ——

植物材料

在位于中國山東半島北側(cè)的榮成(37°16′N, 122°41′E)3 m深度的次潮汐海草床上采集到根莖系統(tǒng)完整(6-9節(jié)間)的健康大葉藻。在2019年5月連續(xù)幾天的下午晚些時候進行采樣。大葉藻在實驗前在過濾海水水族館預(yù)培養(yǎng)3天，在15℃和100μmolm-2s-1，以10:14-h的光：暗周期進行照明。根據(jù)最小飽和光強度，照明由A型LED燈提供，色溫范圍6000 K。從葉鞘上方2厘米處采集葉片進行實驗測量，以保持相同的年齡。

進化分析

基于29個NDH亞單位的串聯(lián)序列，采用MEGA 5.0程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行了1000次重復(fù)的bootstrap測試。這30個物種的所有這些序列都是通過BLASTP分析從國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)檢索到的。交互式生命樹(https:// url .embl.de/)用于對樹進行注釋和修飾。

光處理和抑制劑處理

暗適應(yīng)過夜的大葉藻暴露在三種不同的光強度，50,300和600μmolm-2s - 1反應(yīng)3小時。這些處理在下文稱為弱光（LL）、中光（ML）和強光（HL），它們通過德國DUAL-PAM-100來測量最小飽和光強來確定。所有處理均在光照培養(yǎng)箱(GZP-250N，上海森欣實驗儀器有限公司)中進行，控制海水溫度為15℃，模擬其在自然環(huán)境中的生長狀態(tài)。光由A型LED燈提供，色溫范圍6000 K。在測定熒光動力學(xué)之前，隨機選取暴露于光照下的葉片，每隔20分鐘至暗適應(yīng)15分鐘。Antimycin A (AA, Sigma)和rotenone (Aldrich)分別用于抑制PGR5/L1和NDH依賴的PSI-CEF。分別以甲醇和二甲亞砜為溶劑，制備了AA和魚藤酮原液。處理后樣品的溶劑濃度低于1% (v/v)。葉片使用過濾海水或含1μM AA, 150μM魚藤酮的海水進行飽和，并在光處理之前，在15℃的黑暗條件下孵育葉片1 h。

葉綠素A熒光和P700測定

利用DUAL-PAM-100測量系統(tǒng)同時測量葉綠素a熒光和P700+吸光度變化。在微弱的調(diào)制光下（5μmol m-2s-1）測量出最小熒光值（Fo）后，分別對暗適應(yīng)和光適應(yīng)條件下的葉片在300ms的飽和脈沖光下（16000μmol m-2 s-1）測量Fm和Fm’。Fs是光照條件下的穩(wěn)態(tài)熒光值。P700+的信號會在最小（完全還原）和最大（完全氧化）之間變化。最大的變化在P700完全氧化狀態(tài)(Pm)和一個給定的光狀態(tài)(Pm’)是在遠紅光(250μmol m? 2 s?1)和光化光（127μmol m? 2 s?1）預(yù)照射后由飽和脈沖光測量。PSII的最大光量子產(chǎn)量：Fv/Fm = (Fm ? Fo)/Fm，PSII的電子傳遞速率：ETRII = 0.84 × PPDF × 0.5 ×( -Fm’—Fs)∕Fm’，PSI的電子傳遞速率：0.84 × PPDF × 0.5 ×( -Pm’—P)/Pm，PSI-CEF：ETRI-ETRII。

暗適應(yīng)樣品在光化光下照射2min，在關(guān)閉AL后，我們監(jiān)測了隨后葉綠素熒光的瞬時增加作為NDH活性的一個指標，關(guān)閉AL后10 s內(nèi)測定鼓包的初始斜率。根據(jù)Li等人的方法，在暗適應(yīng)葉片中，當光誘導(dǎo)吸光度在830nm處發(fā)生變化時，監(jiān)測P700+的還原動力學(xué)。我們測量P700的再次還原之前采用一個專用校準程序?qū)700信號進行歸一化處理。遠紅光照射后10 s內(nèi)測定P700+再還原半衰期縮短(t1/2)，表明PSI-CEF活性升高。

快速OJIP熒光瞬態(tài)測量

利用多功能植物效率分析法測定葉綠素熒光快速誘導(dǎo)曲線。由曲線得到如下數(shù)據(jù)：20 μs的最小熒光值（Fo），最大熒光值（Fm），0.3ms的熒光值（K-step，F(xiàn)k），3ms的熒光值（J-step，F(xiàn)j），30ms的熒光值（I-step，F(xiàn)i）。為了評價PSII的活性，計算了PSII從光子吸收到系統(tǒng)間電子受體減少的能量守恒性能指數(shù)(勢)：PIABS=4 ×(Fk ? Fo) × Fm × (Fm ? FJ)/Fv × (FJ ? Fo)2，作為PSII供體側(cè)指標監(jiān)測的k步歸一化可變熒光被計算為WK = (Fk?Fo)/(FJ?Fo)。

ECS分析

電致變色效應(yīng)吸光度信號變化的測量是用DUAL-PAM-100的P515/535模塊在515nm波長下進行監(jiān)測。樣品先暗適應(yīng)15min，再在127μmolm-2s-1的光化光下照射5min，然后再進行測量。AL被關(guān)閉，記錄ECS的衰變動力學(xué)，以確定總ECS，代表了總質(zhì)子動能(pmf)的大小及其組成部分，即ΔpH和Δψ。ECS衰減(gH+)是通過最初的300ms響應(yīng)速率到P515發(fā)射結(jié)束來估計的。

免疫印跡分析

從處理的葉片中分離出葉綠體按照是廠家的指導(dǎo)使用Plants Leaf Chloroplast Rude Divide Kit測量。葉綠素含量測定采用Porra等人的方法。根據(jù)Towbin等人的描述，對NdhH、NdhS、PGR5、PGRL1、PsbO、PsbP和PsbQ(Agrisera，瑞典)的抗體進行Westernblot分析。采用Rubisco大亞單位抗體(RbcL, Agrisera，瑞典)作為內(nèi)參對照。用凝膠對x射線膠片上產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光帶進行密度測量使用圖像實驗室軟件對Doc XR+系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)進行量化。每個目標條帶的總密度都是基于RbcL密度進行標準化的。

數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。所有參數(shù)均采用單因素方差分析。采用Tukey趨勢檢驗進行事后比較。差異有統(tǒng)計學(xué)意義P < 0.05。使用Origin9.0程序，采用單指數(shù)函數(shù)擬合法對P700+再還原的每個點進行擬合。使用線性回歸分析來評估WK，PIABS，和鼓包。

—— 結(jié)果 ——

NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生分析

基于連接的29個NDH亞基序列構(gòu)建了葉綠體NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生樹，顯示了NDH復(fù)合序列在藍藻、苔蘚、蕨類、蕨類和石生植物中NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在藍藻門，輪藻門和蕨類植物NDH復(fù)合物均不完整，并且部分被子植物中也缺失部分NDH亞基的。Z.marina包含五個完整的NDH亞復(fù)合物。海洋植物中除了原始藻類之外，綠藻、硅藻、紅藻和褐藻等常見藻類都缺少編碼葉綠體NDH復(fù)合體亞基的同源基因，這表明Z. marina中NDH復(fù)合體的存在可能在光合作用中發(fā)揮重要作用。

圖1 葉綠體NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生樹

PSI循環(huán)電子流的動態(tài)變化

以ETRI-ERTII為代表的PSI-CEF的活性在三個水平的照射下逐漸增加。同樣，P700+再誘導(dǎo)所示的PSI-CEF活性也隨著光強的升高而逐漸升高。這些結(jié)果表明，大葉藻PSI-CEF隨著光照時間的延長逐漸增強，同時也會隨著光照強度的增強而增強。

圖2 在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）處理條件下ETRI-ETRII隨時間的變化過程。平均值±SD由四個獨立樣本計算。采用Tukey趨勢檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)

圖3 a在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）處理條件下P700+再還原半衰期隨時間的變化過程。平均值±SD由四個獨立樣本計算。每個點表示對指數(shù)函數(shù)的擬合（所有R2值＞0.96）

兩個PSI循環(huán)電子途徑的動態(tài)變化

利用光照后葉綠素熒光的瞬時增強來測定NDH依賴的PSI-CEF。如圖4a所示，葉綠素熒光在光照后出現(xiàn)了明顯的瞬時增強，且這種增強在HL條件下大于ML大于LL光照處理。此外，光照后的初始斜率隨著曝光時間的增加而逐漸增大(圖4c)，說明NDH依賴的PSI-CEF被顯著激活。為了確定處理過量照射的兩個PSI-CEF通路的持續(xù)響應(yīng)，我們使用從Z. marina葉子中分離的葉綠體，使用特異性抗體進行免疫印跡分析。針對NdhH亞基的抗體只能識別45kDa的一個多肽，而抗NdhS的抗體只能識別27-kda的一個蛋白。每個樣本中，anti-PGR5識別一個15-kda蛋白，anti-PGRL1識別一個29-kda蛋白（圖5）。光密度分析顯示，NdhH和NdhS蛋白水平所描述的ndh依賴通路活性明顯隨暴露時間的延長而逐漸增加。相比之下，由PGR5和PGRL1蛋白水平表達的PGR5/L1相關(guān)的通路活性在光照開始后的早期最高，隨后下降到穩(wěn)定水平(圖5b)，表明PGR5 /l1依賴和nndh依賴的PSI-CEF通路可能在不同的光照期交替作用。

圖4 a一種監(jiān)測NDH活性的經(jīng)典葉綠素熒光追蹤，b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）條件下照射3h后鼓包的響應(yīng)。b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）條件下鼓包的初始斜率隨時間的變化過程。平均值±SD由四個獨立樣本計算。采用T檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)